انجمن ميكروبيولوژي ايران

آماده سازی محیط کشت

بررسی خصوصیات ظاهری یک میکروارگانیسم، شناسایی آن را ممکن می‌سازد، بدین منظور باید شرایط رشد میکروارگانیسم را فراهم نمود. رشد ارگانیسم در محیط کشت مصنوعی (ساختگی) ضروری است و اگر بیش از یک گونه یا نوع از ارگانیسم در محیط بررسی وجود داشته باشد هرکدام باید به طور خالص جداسازی و سپس مورد شناسایی قرار گیرد. برای دستیابی به این هدف، سه اقدام لازم است:

1- تهیه محیط کشت مناسب

2- حذف اولیه ارگانیسم های مزاحم و ناخواسته از محیط کشت و ظروف کشت. با توجه به حضور گسترده انواع باکتری در محیط زیست کلیه اجزاء مورد استفاده در محیط کشت نیز باید به نحو مناسب استریل گردند.

3- کشت ارگانیسم و جداسازی آن از سایر ارگانیسم‌های موجود همراه .

محیط های کشت به سه دسته جامد، نیمه جامد و مایع تقسیم می‌شوند که این بستگی به میزان آگار موجود در محیط دارد. آگار یک ماده شیمیایی مستخرج از بعضی جلبک‌های دریایی می‌باشد که در محلول‌های آبکی ، ایجاد اقوام نسبی می‌کند که در تمام دماهای انکوباسیون به صورت جامد باقی می‌ماند و عموماً ویژگی‌های آن نیز، در اثر رشد باکتری‌ها ثابت و بدون تغییر می‌ماند. اما گونه‌های خاصی از باکتری‌های دریایی، قادر به تجزیه محیط جامد و تبدیل آن به مایع می‌باشند ژلاتین نیز نوعی قوام دهنده است که می‌تواند در ساخت محیط کشت جامد مورد استفاده قرار گیرد، با این حال آگار مناسب تر از ژلاتین است زیرا محلول 15 درصد ژلاتین در دمای 24⁰C ذوب می‌شود ژلاتین نیز توسط بسیاری از باکتری‌های پروتئولیتیک تجزیه می‌شود بطور کلی، آگار چیزی به خواص غذایی یک محیط کشت اضافه نمی‌کند آگار در دمای حدود 95 درجه سانتیگراد ذوب و در دمای حدود 42 درجه سانتیگراد به حالت جامد در می‌آیند.جزء مهم آگار یک پلی ساکارید با زنجیره بلند است که عمدتاً از واحدهای D- گالاکتو پیرانوز ساخته می‌شود.

Blood Agar

از بلاد آگار به طور گسترده‌ای در باکتری شناسی پزشکی استفاده می‌شود، این محیط علاوه بر اینکه یک محیط غنی شده است، یک محیط شاخص برای نشان دادن خواص همولیتیک باکتری‌هایی مثل استرپتوکوک پنوموینه و استرپتوکوک پاپوژنز نیز می‌باشند.

براساس دستور ساختی که روی هر بسته محیط کشت قید شده پودر بلادآگار را وزن نموده و در مقدار مشخص آب مقطر بریزید پس از حرارت دادن و ذوب کامل پودر آن را در 121 درجه سانتیگراد برای 15 دقیقه اتوکلاو نمایئد پس از خروج از اتوکلاو و سردشدن تا دمای 50⁰C تا 55⁰C حدود 10 درصد خون گوسفند اضافه نماید و پس از مخلوط کردن به آرامی داخل پتری دیش ازمایشگاهی تقسیم کنید. و بگذارید سرد شود. اگر قصد ساختن آگار شکلاتی ChoColate Ajar را دارید پس از افزودن خون به بلاد آگار آن را در دمای 75 تا 80 درجه قرار دهید تا محیط آگار شکلاتی داشته باشید.

Mueller Hinton Agar محیط مولر هینتون آگار

این محیط کشت در اصل برای جداسازی گونه نیسریابی بیماری زا فرموله شد. امروزه بیشتر در ارتباط با دیسک‌های آنتی بیوتیکی با توان بالا برای تعیین الگوهای حساسیت آنتی بیوتیکی بکار می‌رود. روش ساخت آن بسیار ساده است پس از وزن مقدار مشخص از پودر آن را در آب مقطر استریل و در روی شعله حرارت داده تا پودر کاملاً حل شود سپس در اتوکلاو 121 درجه سانتیگراد برای 15 دقیقه استریل نمایئد پس از خروج از اتوکلاو و سرد شدن تا 50 درجه سانتیگراد آن را در ظروف پتری دیش تقسیم کنید ضخامت محیط کشت از چهار میلیمتر بیشتر نگردد.

محیط Macconkey Agar

این محیط برای کشت انتروباکتریاسه مفید است و محتوی نمک صفراوی است تا باکتری‌های غیر روده‌ای را مهار کند و نیز برای تشخیص کلی فرم‌های تخمیر کننده لاکتوز از سالمونلاهای غیر تخیمرکننده لاکتوز و گروه دیسانتری، حاوی لاکتوز یا قرمز خنثی (Neutra red )است.

Bismuth Sulfite Ajar

بیسموت سولفیت آگار مناسب برای جداسازی سالموفلاتایفی و دیگر بایسل‌های روده‌ای است روش ساخت آن مطابق دستور الصاقی روی ظرف میحط کشت است. بیسموت سولفیت آگار یک محیط کاملاً مغذی به علت وجود پپتون‌ها، عصاره گوشت گاو و دکستروز است. سولفات فروز، معرف تولید سولفیدهیدروژن است بیسموت فلز سنگینی است که خاصیت مهار کنندگی بعضی از میکرو ارگانیسم‌ها را دارد رنگ بریلیانت گرین نیز به عنوان مهار کننده است حضور این مهار کننده‌ها باعث مهار باکتر‌ی‌های گرم مثبت و بیشتر ارگانیسم‌های گرم منفی روده‌ای به جز اکثر گونه‌های سالمونلا و بعضی از گونه‌های شیگلا می‌شود. ممکن است گونه سالمونلا براساس ظاهر و رنگ کلونی احتمالی شنساسایی گردد. رنگ سیاه یا سبز ایجاد شده، یک رسوب فلزی است که وقتی سولفید هیدروژن (که توسط سالمونلا از ترکیبات سولفور در میحط ایجاد شده) با یک نمک آهن واکنش بدهد، تولید می‌شود. به طور شاخص کلونی ها سیاه یا سبز هستند و ممکن است با هاله سیاه یا قهوه‌ای تیره با درخشندگی فلزی سبز احاطه شده باشند.

ظاهر کلونی‌های شاخصی (Typic) و واکنش آنها روی بیسموت سولفیت آگار به شرح زیر است :

Salmonella typhi : کلونی‌های مسطح، خشک، سیاه مرمری احاطه شده با هاله‌های سیاه مایل به قهوه‌ای در محیط معمولاً درخشندگی فلزی وجود دارد.

Salmonlla typhi : کلونی‌های سیاه مرطوب، بدون هاله

S Paratyphi – S. Cholerasuis – S.gallinanum – morganella morganij کلونی‌ سبزبدون هاله

Shigella spp مهار می‌شود، اما اگر رشد کند، کلونی‌های سبز مایل به قهوه‌ای دارد این محیط کشت احتیاج به اتوکلاو ندارد.

محیط Cary and Blair Transport medium  

این محیط برای جمع‌آوری و حمل نمونه‌های بالینی به کار می‌رود. در سال 1964 Cary and Blair فرمول جدیدی را شرح دادند که برای انتقال نمونه‌های مدفوع درست شده بود. محیط آنها حاوی مقدار ماده‌ مغذی کم، پتانسیل اکسید و احیاء پائین و PH بالا بود Cary و همکارانش روی بقاشیگلا و سالمونلا در این محیط تحقیق کردند. در بررسی 162 نمونه مدفوع، ارگانیسم های شیگلا برای 49 روز قابل جداسازی بودند سالمونلاها برای 45 روز در پی تلقیح سازی وقتی آلوده کننده‌های پروتئوسی و سودوموناسی وجود داشتند و برای 62 روز در غیاب این آلوده کننده‌ها، قابل جداسازی بودند.

Gaines و همکارانش یک سلسله آزمایش روی Cary and Blair Transport medium برای جمع‌آوری نمونه‌های مدفوع یا رکتال سواب در منطقه‌ای از تایلند که اسهال اندمیک بود انجام دادند آنها نتیجه‌گیری کردند که این محیط کشت روشی کارا و موثر را برای انتقال نمونه‌های مدفوع فراهم می‌کند.این محیط با حداقل مواد مغذی، فرموله شده تا بقای ارگانیسم را بدون پاسخ و دفاع افزایش دهد. تایوگلیکولات سدیم اضافه می‌شود تا پتانسیل اکسید و احیای پائینی را فراهم کند، PH نسبتاً بالا نابودی باکتری‌ها به علت تشکیل اسید را کاهش می‌دهد. سواب‌های فرو رفته در مدفوع یا نمونه‌های دیگر را داخل لوله‌های محتوی محیط ترانسپورت (انتقالی) قرار دهید. لوله‌ها در طی حمل به آزمایشگاه در دمای اتاق نگهداری می شوند به محض رسیدن لوله‌ها به آزمایشگاه باید از سواب‌های برای تلقیح محیط‌های مغذی استفاده کرد. محیط کری بلر را پس از آماده سازی تا یک سال در دمای اتاق می‌توان نگهداری کرد.

محیط EMB

این محیط کشت افتراقی- انتخابی مفیدی در جداسازی و شناسایی باکتری‌های روده‌ای گرم منفی است رنگ ائوزین و متیلن بلو، اجزای انتخابی هستند که افزوده شده‌اند تا در حالی که به باکتری‌های گرم منفی اجازه رشد می‌دهند، از رشد باکتری‌های گرم مثبت جلوگیری کنند کربورهیدرات‌های لاکتوز و ساکاروز افزوده شده اند تا ایزوله‌ها را براساس تخمیر لاکتوز تفکیک کنند. تخمیر با تغییر رنگ و  رسوب رنگ‌های افزوده شده در اثر افت PH مشخص و ارزیابی می‌شود ساکاروز به عنوان منبع کربوهیدرات دیگری برای تخمیر کنندگان شوند و به موقع حذف گردند.اشریشیا کلی، یک کلی فرم تخمیر کننده لاکتوز است که به طو شاخص و تیپیک، کلنی‌های آبی- سیاه با درخشندگی فلزی متمایل به سبز ایجاد می کند.

دیگر کلی فرم‌های تخمیر کننده مثل انتروباکتری، کلنی های صورتی تشکیل می دهند.کلنی‌های غیر تخمیر کننده شفاف بوده کهربایی رنگ یا بی رنگ هستند.

Gram nejative (GN) broth

GN broth  برای  غنی سازی انتخابی سالمونلا و شیگلا به کار می‌رود. GN  به عنوان یک محیط غنی برای جداسازی سالمونلا و شیگلا ازنمونه‌های بالینی و غیربالینی توسط Hajna مطرح شد.

Croft and miller  در جداسازی انواع شیگلا با استفاده ازاین محیط، در مقایسه با کشت مستقیم موفق شدند. Taybr and Schlart گزارشی کردند که GN broth جداسازی پاتوژن‌های روده‌ای را با 53 درصد افزایش در شیگلا و 36 درصد افزایش در سالمونلا در مقایسه با کشت مستقیم افزایش داده است در مطالعه دیگر Taylor and Schelhart نشان دادند که GN broth نسبت به محیط‌های غنی کننده سلنیت (Selenite Enrichment media) برای جداسازی شیگلا برتر است.

عصاره آنزیماتیکی کازئین و بافت حیوانی، اسیدهای آمینه و دیگر مواد نیتروژن دار را جهت تقویت رشد باکتریایی فراهم می‌کنند. مانیتول و دکستروز منابع انرژی هستند. مانیتول در غلظتی بالاتر از دکستروز تهیه می‌شود تا رشد گونه‌های تخمیر کننده مانیتول مثل سالمونلا و شیگلا را افزایش دهد و رشد پروتئوس و دیگر باکتری‌های تخمیر کننده دکستروز را محدود کند. بافر‌های فسفات اضافه می‌شوند تا PH محیط را حفظ کنند. سیترات سدیم و دزوکسی کولات سدیم اضافه می‌شوند تا رشد باکتری‌های گرم مثبت و بعضی از باکتری‌های گرم منفی را مهار کنند.

Hekton Enteric Agar :

این محیط به خاطر خاصیت انتخابی محدودش قابل ملاحظه است و مخصوصاً در جداسازی گونه شیگلا مفید است. فرمول موجود، به علت اینکه دزوکسی کلات سدیم در آن حذف شده و غلظت‌ نمک‌های صفراوی کاهش یافته است. به علاوه به منظور خنثی کردن اثرات مهار کنندگی نمک صفراوی غلظت پیتون در آن افزایش یافته است از فرمول اصلی متفاوت است HE Ajar به عنوان یکی از چندین محیط تهیه شده در پلیت برای کشت انتروباکتری یاسه از نمونه‌های مدفوع توصیه می شود. که به خاطر خاصیت انتخابی محدود و نیزخاصیت تفکیک آن است. طبیعت انتخابی HE Agar ناشی از افزودن نمک‌های صفراوی درفرمول آن است. این مواد، ارگانیسم‌های گرم مثبت را مهار می‌کنند، اگرچه می‌توانند برای بعضی از انواع گرم منفی سمی باشند این محیط حاوی سه کربوهیدرات لاکتوز، ساکارز و سالیسین برای تفکیک‌ مطلوب پاتوژن‌های روده‌ای از طریق رنگ کلنی‌ها و محیط مجاور به کلونی‌ها است. برای انتریک های به منظور کمک در مشاهده پاتوژن‌های روده‌ای و به حداقل رساندن مشکل تأخیر در تخمیرلاکتوز، غلظت لاکتوز بالاتر از بسیاری از محیط های دیگر است.

سیترات آمونیم فریک و تیوسولفات سدیم در محیط قادر به نشان دادن تولید سولفید هیدروژن هستند در نتیجه به علت تولید کلنی هایی بامراکز سیاه به مرحله تفکیک کمک می‌کنند سیستم اندیکاتور شامل اسید فوشین و برم تیمول بلو، نسبت به بسیاری از محیط‌های روده‌ای دیگر سمیت کمتری دارند در نتیجه در جداسازی بهتر پاتوژن‌های روده‌ای موثر است محیط را تا نقطه جوش حرارت دهید ولی از گرمادهی بیش از اندازه پرهیز کنید محیط را هرگز اتوکلاو نکنید.

سالمونلا روی این محیط کلنی‌های سبز متمایل به آبی با کانون سیاه ایجاد می کنند شیگلا کلنی سبزرنگ تولید می‌کنند.

E.coli:

کلنی‌های صورتی تا نارنجی رنگ با هاله هایی از رسوب صفرا دارند.

Kligler Iron Agar

این محیط کشت برای تفکیک اعضا خانواده انتروباکتریا سه براساس توانایی در تخمیر دکستروز ولاکتوز و تجزیه سولفیدها به کار می‌رود درسال 1911 Russell یک محیط لوله‌ای دو قندی جدید را برای جداسازی باسیل‌های تیفوئید از ادرار و مدفوع شرح داد. شش سال بعد Kligler محیط استات سرب (Lead acetate) ساده را برای تکفیک گروه تیفوئید- پاراتیفوئید توسعه داد. بعداً Kligler محیطهای کشت مورد استفاده در جداسازی و تفکیک تیفوئید، دیسانتری و باسیل‌های وابسته را ارزیابی کرد و محیط Russell را تأیید نمود. Bailey and Lacey فنل رد را به جای معرف Andrade که قبلاً به عنوان معرف PH به کار می‌رفت، جایگزین کردند.

در فرمول رایج Kligler Iron Agar ترکیبات محیط استات سرب Kligler با آگار دوقندی Russell آمیخته می‌شود.

KIA علاوه بر کازئین و پیتونهای گوشت (meat peptones) محتوی لاکتوز و دکستروز است که به واسطه تغییر رنگ معرف PH (فنل رد) در پاسخ به اسید تولید شده در طی تخمیر این قندها، قادر است گونه با سیل‌های روده‌ای را تفکیک کند. غلظت دکستروز فقط 10 درصد غلظت لاکتوز است ترکیب ستیرات آمونیم فریک و تیوسولفات سدیم، شناسایی تولید سولفید هیدروژن را میسر می‌سازد، غیر تخمیر کننده‌های لاکتوز (مثل سالمونلا و شیگلا) در ابتدا سطح شیب دار زرد رنگی را تولید می‌کنند که ناشی از اسید تولید  شده به دلیل تخمیر مقدار کمی دکستروز است. وقتی دکستروز تمام می‌شود، در محیط هوازی سطح شیب‌دار به علت اکسیداسیون اسیدها واکنش به قلیایی (سطح شیب‌دار قرمز) برمی‌گردد. این برگشت در محیط بی هوازی عمق رخ نمی دهد و اسیدی باقی می‌ماند (عمق زرد) تخیمر کننده های لاکتوز سطح و عمق زرد تولید می‌کنند. چون اسید کافی در سطح شیب‌دار تولید می‌شود تا PH اسیدی را تحت شرایط هوازی حفظ کند. ارگانیسم‌های ناتوان در تخمیر دو کربوهیدارت سطح و عمق قرمز تولید می‌کنند.

تولید H2S با ایجاد رنگ سیاه در تمام عمق یا با تشکیل یک حلقه در تردیکی بالای عمق ثابت می‌شود، تولید گاز به صورت ایجاد حباب‌های تکی، یا با شکافتن یا جابجا شدگی آگار نشان داده می‌شود.برای بالا بردن شرایط قلیایی در سطح شیب‌دار، با شل کردن در پوش لوله، اجازه داده می‌شود که تبادل هوا صورت گیرد. اگر در پوشی لوله محکم بسته شود، یک واکنش اسیدی ( ایجاد شده فقط با تخمیر دکتروز) سطح شیب‌دار را دربرمی‌گیرد.

Salmonelaa ®ALK/ ACID    H2S⁺ gas⁺

Shigella ®ALK/ACID

E.Coli®ACID/ACID     gas⁺

Lysine Iron Agar

این محیط برای تفکیک ارگانیسم های روده‌ای براساس توانایی در دکربوکسیله یا دآمینه کردن لیزین و تشکیل سولفید هیدروژن به کار می‌رود.

کشت‌هایی از باسیل‌‌های روده‌ای که سولفید هیدروژن تولید می‌کنند، به علت تولید سولفید فروز باعث سیاه شدن محیط می‌شوند. آنهایی که لایزین دکربوکسیلاز تولید می‌کنند، واکنش قلیایی (ارغوان رنگ) یا واکنش خنثی در عمق محیط ایجاد می‌کنند. ارگانیسم‌هایی که لایزین را در آمینه می‌کنند، باعث گسترش رنگ قرمز در سطح بر روی عمق اسیدی می‌شوند. ممکن است گاز تشکیل شود اما تشکیل آن اغلب نامنظم و بی قاعده است، یا اینکه مهار می‌شود.

با استفاده از نیدل سوزنی، بارشدی از یک کشت خالص، عمق را دوبار سوراخ نموده و سپس سطح شیب‌دار را کشت دهید. لوله‌ها را با درپوش‌های شل شده به مدت 24-18 ساعت در دمای 2⁰c ±35 در اتمسفر هوازی انکوبه نمائید.

قلیایی= رنگ ارغوانی   اسیدی= رنگ زرد   خنثی= رنگ خاکستری مایل به آبی

MR-VP Broth

این محیط کشت برای تفکیک و افتراق باکتری‌ها براساس واکنش‌های میتل رد Voges and proskauer در نیمه دوم قرن نوزدهم مشاهدات اولیه خود را در رابطه با تولید رنگ قرمز، بعد از افزودن هیدروکسید پتاسیم به محیط‌های کشت ویژه‌ای که ارگانیسم‌های گوناگون روی آنها رشد کرده‌اند، اعلام کردند.

Clark and Lubs در سال 1951 پی بردند که افزودن میتل رد به کشت‌های اشریشیا کلی سبب تولید رنگ قرمز به علت اسیدیته بالای تولید شده در طی تخمیر دکستروز می‌شود. مقدار کمتر اسید تولید شده توسط کلبسیلا پنوموته به استوئین تبدیل می‌شود و یک واکنش قلیایی ایجاد می‌کند (آزمایش MR منفی) این محقیقین MR-VP Broth را به گونه‌ای توسعه دادند که قادر باشند هر دو آزمایش را در همان محیط یا روی دو لوله جداگانه یا روی دو قسمت مساوی از یک لوله انجام دهند.

رنگ قرمز تولید شده با افزودن هیدروکسیدپتاسیم به کشت‌ها بعضی از گونه‌های میکروبی، ناشی از توانایی ارگانیسم‌ها در تولید محصول نهایی خنثی یعنی استوئین (استیل میتل کربینول) از تخمیر دکستروز اس. استوئین در حضور اکسیژن و قلیای اکسید می‌شود تا دی استیل را تولید کند که آن با کراتین (Creatine) واکنش می‌دهد تا رنگ قرمز تولید کند. این یک واکنش VP مثبت است.

ارگانیسم های میتل رد مثبت مقادیر زیادی اسید در طی تخمیر دکستروز تولید می‌کنند که بر سیستم بافرفسفات غلبه می‌یابد و به محض افزودن معرف PH (میتل رد) رنگ قرمز تولید می‌کند. پنج قطره  معرف میتل رد را به یک قسمت از براث اضافه کنید.نتیجه رنگ را فوراًتفسیر کنید.

الف: مثبت- رنگ قرمز سطح محیط     ب: منفی- رنگ زرد سطح محیط

6درصد میلی لیتر محلول    a  - نفتول و 2درصد میلی لیتر محلول KOH را به 1 میلی لیتر از کشت اضافه کنید بعد از اضافه کردن هر معرف لوله را خوب تکان دهید. واکنش‌های مثبت یکباره یا در طی 5 دقیقه ایجاد و با تولید رنگ قرمز مشخص می‌شوند.

Mueller- Hinton Ajar

مولرهینتون آگار، یک محیط شفاف و مفید در تست تعیینی حساسیت ارگانیسم‌ها نسبت به آنتی بیوتیک ها است. این محیط همچنین برای آزمایش هیدرولیز نشاسته مفید است. چون مولر هینتون آگار متحوی animal infusion ، کازامینواسیدها (animal acids ) و نشاسته است، رشد بیشتر ارگانیسم‌ها را تقویت می‌کند. همچنین می‌توان به منظور انجام تست تعیین حساسیت بر روی استرپتوکوک‌ها، به فرمول پایه، خون گوسفند اضافه نمود. افزودن خون گوسفند گرم شده یا شکلات شده به مولر هینتون آگار، امکان آزمایش برای ارگانیسم‌های سخت رشد (Fastidious) مثل هموفیلوس و نیسریا را فراهم می‌سازد. نشاسته به دو منظور در محیط کشت موجود است، می‌تواند از ارگانیسم ها در مقابل مواد سمی محافظت کند همچنین به عنوان منبع انرژی عمل می‌کند. در آزمایش ایزوله های سودوموناس با آنتی بیوتیک‌های آمینوگلیکوزید، غلظت یون‌های Ca²⁺ و Mg²⁺ مهم و اساسی است.

Mac con key Agar

یک محیط انتخابی و افتراقی برای نشان دادن ارگانیسم‌های کلی فرم و پاتوژن روده‌ای است. Mac Conkey یکی از قدیمی‌ترین محیط‌ها را برای کشت و تشخیص میکرو ارگانیسم‌های روده‌ای توسعه داد. این محیط، محتوی نمک‌های ولاکتوز بود که به انتخاب و افتراق گروه روده‌ای کمک می‌کرد.

غلظت نمک‌های صفراوی در این محیط، در مقایسه با دیگر محیط‌های پلیتی روده‌ای نسبتاً کم است، بنابراین انتخابی بودن این محیط برای باکتری‌های گرم منفی، زیادتر از بعضی فرمول‌های دیگر نیست (مثل S.S Agar یا HE Agar ) کریستال ویوله، میکرو ارگانیسم های گرم مثبت بویژه انتروکوک‌ها و استافیلوکوک‌ها را مهار می‌کند.

تفکیک میکروارگانیسم‌های روده‌ای با ترکیب لاکتوز و معرف قرمز خنثی به دست می‌آید. بسته به توانایی تخمیر لاکتوز، کلنی‌های بی رنگ یا صورتی- قرمز تولید می‌شوند.

-        Escherichia Coli رشد می‌کند، کلنی‌های قرمز گل سرخی می‌دهد.

-        Proteus mirabilis رشد می‌کند، کلنی‌های بی رنگ می‌دهد.

-        Salmonella typhimurium رشد می‌کند، کلنی های بی رنگ می‌دهد.

Nutrient Agar

این محیط برای کشت باکتری‌ها و نیز برای شمارش ارگانیسم ها در آب، فاضلاب، مدفوع و نمونه‌های دیگر به کار می‌رود.

Nutrient Agar مرکب از پپتون، beef extract و آگار است. این فرمول نسبتاً ساده مواد مغذی لازم برای تکثیر تعداد زیادی از میکروارگانیسم هایی را که زیاد سخت رشد نیستند، فراهم می‌کند.

Beef extract  محتوی مواد محلول در آب شامل کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، ترکیبات نیتروژن آلی و نمک‌ها است. پپتون‌ها منابعی مهم از نیتروژن آلی، مخصوصاً اسیدهای آمینه و پپتیدهای بلند زنجیره هستند.

Phenol Red Broth Base

این محیط کشت وقتی با کربوهیدرات ها مکمل شود، برای تعیین واکنش‌های تخمیری میکروارگانیسم‌ها به کار می‌رود.

کازئین پپتون، فاقد کربوهیدرات‌های قابل تخمیر است. بنابراین از تولید واکنش‌های مثبت کاذب جلوگیری می‌کند. وقتی با یک کربوهیدرات ویژه مکمل شود (غلظت نهایی 5 درصد کربوهیدرات) واکنش تخمیر کربوهیدرات مثبت، با تولید رنگ زرد ناشی از اثر محصولات اسیدی تخمیر بر روی معرف فنل رد نشان داده می‌شود. تولید گاز با ایجاد حباب‌هایی در لوله‌های دروهام نشان داده می‌شود.

Salmonella Shigella Agar

سالمونلا- شیگلا آگار (SS Agar) یک محیط افتراقی انتخابی برای جداسازی باسیل‌های روده ای بیماری زا، بویژه آنهایی است که وابسته به جنس سالمونلا هستند. این محیط برای جدای سازی اولیه شیگلا توصیه نمی‌شود.

محیط‌های کشت که برای انتخاب و افتراق میکروارگانیسم‌های روده‌ای از مواد بالینی و غیربالینی توسعه یافته‌اند، به علت وجود نمک‌های صفراوی خالص، مخلوطی از نمک‌های صفراوی یا رنگها گونه‌های گرم مثبت را با درجات متفاوتی مهار می‌کنند. SS Agar نمونه ای از محیط‌های محتوی مخلوط نمک‌های صفراوی است. به علت نسبتاً بالا بودن میزان خاصیت انتخابی این محیط ممکن است بعضی از انواع شیگلا بر روی آن رشد نکنند. بنابراین برای جداسازی مقدماتی شیگلا، این محیط توصیه نمی‌شود. محیط‌های توصیه شده برای جداسازی شیگلا، XLD Agar و Hektoen Enteric Agar هستند. SS Agar به عنوان یک محیط نسبتاً انتخابی برپایه درجه مهار میکروارگانیسم‌های گرم مثبت طراحی شده است. که به علت وجود نمک‌های صفراوی، بریلیانت گرین و سیترات رشدشان مهار می‌شود. افتراق و تفکیک ارگانیسم های روده ای، با افزودن لاکتوز به محیط حاصل می‌شود. ارگانیسم‌هایی که لاکتوز را تخمیر می‌کنند، اسید تولید می‌نماید که در حضور معرف قرمز خنثی (neutral red) کلنی‌های قرمز رنگ تشیکل می‌دهند. غیرتخمیر کننده‌های لاکتوز، کلنی‌های بی رنگ تشیکل می‌دهند. گروه دوم شامل اکثر یاتوژن‌های روده‌ای (سالمونلا و شیگلا) است. تیوسولفات سدیم و سیترات فریک قادرند تولید سولفید هیدروژن را ردیابی کنند، به طوری که کلنی‌هایی با مراکز سیاه ایجاد می‌شود. این محیط احتیاج به اتوکلاو ندارد.

Selenite-F Broth

این محیط کشت به عنوان یک محیط غنی برای جداسازی سالمونلا و بعضی از گونه‌های شیگلا به طور مثال شیگلا سونئی از مدفوع ، ادرار، آب، غذاها و دیگر مواد بهداشتی مهم به کار می‌رود. این محیط توسط Leifson درست شد، کسی که نشان داد سلینت برای کلی فرم‌ها و بعضی از گونه‌های میکروبی دیگر، همچون استرپتوکوک‌های مدفوعی موجود در نمونه‌های مدفوع مهار کننده است و بنابراین در جداسازی گونه‌های سالمونلا سودمند بود. او پی برد که سرانجام گونه‌های مهار شده به طور کامل از بین خواهند رفت اما اگر ساب کالچر از براث غنی تهیه شود بعد از 12-8 ساعت انکوباسیون، جداسازی سالمونلا بدون از بین رفتن بسیاری از اعضای فلور روده ای امکان پذیر خواهد بود.

محیط‌های غنی به طور روتین برای جداسازی پاتوژن‌ها در نمونه‌های مدفوع به کار می‌روند چون پاتوژن‌ها معمولاً فقط درصد کمی از فلور روده‌ای را نمایش می‌دهند. این محیط برای استفاده در جداسازی سالمونلا کالچرهای تهیه شده بعد از 18-12 ساعت انکوبالیون توصیه می‌شوند. برای جداسازی شیگلا محیط غنی GN Broth برگزیده می‌شود.

SIM medium

این محیط برای تفکیک باسیل‌های روده‌ای براساس تولید سولفید، تشکیل اندول حرکت به کار می‌رود. تولید سولفید هیدروژن، تشکیل اندول و حرکت، ویژگی‌هایی  را تعیین می‌کنند که در شناسایی انتروباکتریاسه مخصوصاً سالمونلا و شیگلا کمک می‌کنند. این محیط را مراحل شناسایی پاتوژن‌های روده‌ای مفید است.

اجزاء SIM medium تعیین سه فعالیت باکتری‌های روده‌ای را که ممکن است متفاوت باشند امکان‌پذیر می‌سازند. یتوسولفات آمونیم فروز، معرف‌های تولید H2s هستند. سولفات آمونیم با گاز H2S واکنش می دهد تا رسوب سیاه سولفید فروز را تولید نماید. پپتون کازئین که سرشار از تریپتوفان است هنگامی که توسط بعضی از میکروارگانیسم ها مورد مصرف قرار می‌گیرد، در تولید اندول اثر می‌گذارد. اندول به دنبال دوره انکوباسیون با افزودن معرف‌های شیمیایی شناسایی می‌شود. شناسایی حرکت به علت طبیعت نیمه جامد (Semi Solid ) محیط امکان پذیر است. رشد خارج از خط کشت مرکزی نشان می‌دهد که ارگانیسم تحت بررسی، متحرک است.

به دنبال انکوباسیون، از نظر وجود حرکت (انتشار رشد در خارج از خط کشت یا ایجاد کدورت در سراسر محیط) و برای تولید H2S (سیاه شدن در امتداد خط کشت) بررسی نمائید. برای بررسی و نشان دادن تولید اندول، 4-3 قطره معرف کواکسی را به لوله اضافه نمائید و رنگ قرمز (برای واکنش مثبت) را بررسی و مشاهده کنید.

Simmons Citrate Ajar

این محیط کشت برای افتراق باکتریهای گرم منفی براساس معرف سیترات به کار می‌رود. Koser در سال 1923 برای تفکیک بین آنچه که اکنون به عنوان اشریشیا کلی و انتروباکتر آئروژنز شناخته شده‌اند، به عنوان بخشی از واکنش‌های  Imvic یک محیط مایع مرکب از نمک‌های معدنی را که در آن نمک آمونیوم تنها منبع نیتروژن تنها مبنع کربن بود، گسترش و توسعه داد. Simmons  درسال 1926 فرمول Kosser را با افزودن 5/1 درصد آگار و برم تیمول بلو اصلاح کرد. ارگانیسم‌هایی که قادر به متابولیزه کردن سیترات هستند، به خوبی بر روی این محیط رشد می کنند.

ارگانیسم‌هایی که قادرند آمونیوم دی هیدروژن فسفات و سیترات سدیم را به عنوان تنها مبنع نیتروژن و کربن مصرف کنند، به طور نسبی بر روی این محیط رشد می‌کنند و واکنش قلیایی تولید می‌کنند که با تغییر رنگ معرف برم تیمول بلو از سبز (خنثی) به آبی (قلیایی) مشخص می‌شود.

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar=TCBS Agar

برای جداسازی انتخابی و پیرویوهای کلرا و پیریوپا را همولیتیکوس از انواع نمونه‌های بالینی و غیربالینی به کار می‌رود.

 محیط پلیتی اولیه که عموماً برای جداسازی انتخابی     ویبریوهای ایجاد کننده وبا اسهال و مسمومیت غذایی استفاده می‌شود یعنی TCBS توسط Kobayashi و همکارانش، کسی که محیط انتخابی Nakanishi را اصلاح کرد توسعه داده شد. ترکیب آب پپتونه قلیایی با TCBS Agar در روش‌های متعددی برای جداسازی ویبریوکلرا و دیگر گونه‌های ویبریو از مدفوع به کار می‌رود.

TCBS برای جداسازی ویبریوکلرا و ویبریوپاراهمو لیتیکوس و نیز ویبریوها کاملاً انتخابی است مهار باکتری‌های گرم مثبت، با افزودن Ox gall  ( صفرای گاوی) که ماده‌ای است که به طور طبیعی به وجود می‌آید و محتوی مخلوط از نمک‌های صفراوی و Sodium Choate که یک نمک صفراوی خالص است، می‌باشد. یتوسولفات سدیم به عنوان منبع سولفور عمل می‌کند و در ترکیب با سیترات فریک تولید سولفید هیدروژن را مشخص می‌کند. ساکاروز به عنوان کربوهیدرات قابل تخمیر برای متابولیسم ویبریوها موجود است PH قلیایی محیط، جداسازی ویبریوکلرا را افزایش می‌دهد. تیمول بلو و برم تیمول بلو، به عنوان معرف‌های تغییر PH موجودند این محیط کشت نباید اتوکلاو گردد.

Triple sugar Iron Agar (TSI)

این محیط کشت برای تفکیک باسیل‌های روده‌ای گرم منفی براساس تخمیر کربوهیدرات و تولید سولفید هیدروژن به عنوان اولین گام به کار می‌رود.

Urea Agar Base

این محیط کشت در تهیه محیط‌هایی جهت تفکیک ارگانیسم‌ها بویژه انتروباکتریاسه براساس تولید اوره آز به کار می‌رود.

 Urea Agar  توسط Christensen برای استفاده به عنوان محیط جامد برای تفکیک باسیل‌های روده‌ای درست شد.

اوره آگار توسط Christensen با افزودن پپتون و دکستروز و کاستن مقدار بافر برای پیشروی سریع‌تر رشد بسیاری از انتروباکتریاسه و در نتیجه کاهش مدت زمان انکوباسیون درست شد.

وقتی ارگانیسم ها اوره را مصرف می‌کنند گاز آمونیاک درطی انکوباسیون تشکیل می‌شود که واکنش این محیط‌ها را قلیایی نموده و رنگ قرمز – صورتی تولید می‌نماید. تولید اوره آز با تغییر در معرف فنل رد نشان داده می‌شود. برای تهیه Urea Agar medium ، 5/1 گرم گرانوله را به 90ML آب خالص اضافه نمائید. آن گرم نموده و به مدت یک دقیقه بجوشانید. سپس محلول آگار را با اتوکلاو کردن در دمای 121⁰C به مدت 15 دقیقه استریل نمائید. آگار را تا دمای 50-45 درجه خنک نمائید و اجازه دهید لوله تهیه شده طبق دستور العمل اول به دمای اتاق برسد. سپس 10ML از این لوله را به 90ML محلول آگار خنک شده، اضافه نمائید و کاملاً مخلوط کنید. در صورت امکان هرچه سریعتر با رعایت شرایط آسپتیک در لوله‌های آزمایش استریل تقسیم نمایید. اجازه دهید لوله‌ها در وضعیت شیب‌دار خنک شوند به طوری که ته لوله‌ها به صورت عمق‌دار تشکیل شود.

15 gr  urea Agar /9oo ml D.W           1.5 gr urea/ 90 ml D.W

XLD Agra

Xylos Lysine Desoxy cholate Agar برای جداسازی و تفکیک پاتوژن‌های روده‌ای بویژه گونه شیگلا توصیه می‌شود انواع زیادی از محیط توسعه داده شده‌اند تا در جداسازی انتخابی و افتراقی پاتوژن‌های روده‌ای کمک کنند. به علت تعداد زیاد گونه‌ها و انواع میکروبی مختلف با تنوع نیازهای غذایی و الگوهای مقاومت شیمیایی، محققین فرمول‌های گوناگونی را برای بررسی و مشاهده نیازهای عمومی و نیز اختصاصی جهت جداسازی و تفکیک میکرو ارگانیسم ها توسعه دادند.

XLD Agar توسط Taylor به منظور افزایش کارآیی جداسازی پاتوژن‌های روده‌ای بویژه شیگلا توسعه یافت. بدین ترتیب پاتوژن‌ها نه تنها از تخمیر کننده های لاکتوز غیرپاتوژن بلکه از بسیاری از غیرپاتوژن‌هایی که ساکاروز یا لاکتوز را تخمیرش کنند، تفکیک می‌شوند. به علاوه این محیط برای افزایش تناوب رشد پاتوژنهای سخت رشدتری که در فرمول های دیگر اغلب به علت دربرداشتن مهار کننده‌های سمی زیاد و بیش از حد قادر به رشد نیستند، فرموله شده است. نتایج به دست آمده در تعدادی از سنجش‌های بالینی، این ادعا را برای کارایی نسبتاً بالای XLD Agar درجداسازی اولیه شیگلا و سالمونلا تأیید کرده است.

XLD Agar هم محیط انتخابی و هم افتراقی است. دزوکسی کولات سدیم در آن به عنوان عامل انتخابی به کار می‌رود. و بنابراین برای میکروارگانیسم‌های گرم مثبت مهار کننده است. گزیلوز (Xylose) به محیط اضافه می‌شود چون عملاً توسط همه باسیل‌های روده‌ای به جز شیگلا ها تخمیر می‌شوند و این خاصیت، افتراق گونه شیگلا را امکان پذیر می‌سازد. لیزین به محیط اضافه شده تا سبب شود گروه سالمونلا از غیر پاتوژن‌ تفکیک بشود، چون بدون لیزین، سالمونلاها گزیلوز را به سرعت تخمیر می‌کنند و از گونه غیرپاتوژن‌ قابل تشخیص نیستند. بعد از اینکه سالمونلاها تخمیر گزیلوز را تمام کردند، لایزین توسط آنزیم لایزین دکربوکسیلاز مورد حمله قرار می‌گیرد و PH به سمت قلیایی برمی‌گردد که واکنش شیلگلاها را تقلید می نماید. برای جلوگیری از برگشتگی مشابه توسط کلی فرم‌های لایزین مثبت برای تولید اسید اضافی، لاکتوز و ساکاروز اضافه شده‌اند. برای افزودن توانایی تفکیک فرمول، یک سیستم معرف H2S شامل تیوسولفات سدیم و سیترات آمونیم فریک به آن اضافه شده است تا با اثر گذاشتن در تشکیل کلنی هایی با مراکز سیاه سولفیدهیدروژن تولید شده قابل مشاهده گردد.تولید کننده‌های H2S غیرپاتوژن لایزین را دکربوکسیلاز نمی‌کنند. بنابراین واکنش اسید تولید شده بوسیله آنها را از سیاه شدن لکنی‌ها جلوگیری می‌کند.